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Sondes d'hybridation

Extrait de Biologie moléculaire, page 148

Figure 9.7 b – Méthodes de détection de l’ADN amplifié.

Les sondes d’hybridation permettent une détection spécifique du matériel amplifié, ce qui est impossible avec le SYBR green. On utilise ici deux sondes supplémentaires dans le mélange réactionnel. Ces deux sondes, complémentaires à des régions voisines à l’intérieur de la molécule d’ADN amplifiée, sont couplées à une molécule fluorescente : l’une est marquée en 3’, et l’autre en 5’. Lorsque le fluorophore de la première sonde est excité avec une longueur d’onde précise, il émet de la fluorescence. Cette fluorescence peut exciter à son tour le fluorophore présent sur la deuxième sonde, qui émettra un signal à une longueur d’onde différente si elle se situe à proximité de la première sonde. Lorsque les deux sondes s’hybrident côte à côte à l’intérieur d’un fragment d’ADN amplifié et qu’il y a excitation du mélange réactionnel par une longueur d’onde appropriée, la proximité des deux fluorophores permet un transfert d’énergie entre ceux-ci; ce phénomène est appelé « FRET », pour Fluorescence Resonance Energy Transfer. Il y a donc émission de lumière correspondant au deuxième fluorophore. En absence d’ADN cible, les sondes sont libres dans le mélange, rendant impossibles le transfert d’énergie et l’émission du deuxième fluorophore. Ainsi, avec l’augmentation spécifique du nombre de produits de réaction au cours des cycles du PCR (réaction de polymérisation en chaîne), il y aura une augmentation du nombre de sondes qui s’y hybrideront. L’intensité de l’émission de lumière augmentera donc en conséquence.

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Date : 2007
Auteur : Joëlle Brodeur, Martin Toussaint,  Projetbleu
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Ayant droit : CCDMD
Catégorie : Pédagogie
Numéro : 55553

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